Axe 5 : nanobiophotonique
Responsable : Rodolphe Jafiol
Membres :
Rodolphe Jaffiol (MdC), Jérôme Plain (MdC HDR), Céline Boutin (doctorante), Pascale Winckler (doctorante)
Travaux récents :
Depuis 2005, nous travaillons sur la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et sur ses applications en biophysique, et plus particulièrement sur la diffusion membranaire dans les cellules vivantes.
En FCS, on illumine avec un faisceau laser un échantillon de molécules fluorescentes localisées dans les membranes des cellules. Dans cette approche "conventionnelle" de la FCS, les fluctuations du signal de fluorescence sont enregistrées tandis que les fluorophores diffusent à travers le volume d'observation, ce dernier résultant d'une détection confocale et d'une importante focalisation du laser d'illumination (voir dispositif ci-dessous). De manière intéressante, l'amplitude des fluctuations ne devient significative que lorsque la concentration des molécules est suffisamment faible, typiquement pour des concentrations nano-molaire (nM). Cette sévère condition de dilution est en réalité très avantageuse, tout particulièrement dans le cadre d'études biophysiques, puisqu'elle ne va pas induire de forte modification du système étudié, présentant alors la FCS comme une technique non perturbative au regard d'études in vivo.
Le signal de fluorescence F(t) est enregistré à l'aide d'une photodiode à avalanche (voir le schéma ci-dessous) et les fluctuations de fluorescence sont analysées en réalisant l'autocorrélation temporelle de F(t), notée G(τ). Le déclin de G(τ), à savoir le temps de diffusion noté τd, correspond au temps moyen nécessaire aux molécules fluorescentes pour traverser le volume d'observation. Pour des molécules qui diffusent dans les membranes plasmiques, ce temps de diffusion est fortement influencé par l'organisation locale et les hétérogénéités de la membrane. Ainsi, réciproquement, la FCS peut être utilisé efficacement pour retrouver l'organisation sub-micrométrique des membranes cellulaires.
Dans le domaine de la recherche sur le cancer, la résistance à la chimiothérapie est principalement liée à des processus biochimiques membranaires. Les interactions entre le médicament et la membrane plasmique mettent en jeu des mécanismes particuliers. Ces derniers peuvent être associés à une modification de la fluidité, de la perméabilité de la membrane, mais aussi à l'apparition de micro-domaines (rafts, caveolae) ou encore des protéines d'expression du rejet. Tous ces mécanismes membranaires peuvent êtres observés en FCS à l'aide de la diffusion latérale de molécules fluorescentes. En conséquence, nous avons utilisé la FCS afin d'explorer la fluidité membranaire de cellules résistantes au traitement anti-cancéreux, en comparaison avec des cellules sensibles au traitement (c'est-à-dire sensibles à l'action des médicaments), mais également afin de caractériser l'influence d'agents membranaires présents dans le milieu extra-cellulaire (comme un modulateur de la fluidité et des révertants dont leur efficacité à inhiber la résistance est reconnue).
Pour chaque catégorie de lignée cellulaire (lignée résistante, sensible,...) une analyse statistique des temps de diffusion enregistrés sur des cellules individuelles, a été réalisées. Deux exemples de distributions des temps de diffusion sont donnés ci-dessous. Différentes informations peuvent êtres extraits de ces distributions. La valeur moyenne nous renseigne sur la fluidité globale de la membrane plasmique. La variance (ou l'écart-type) donne des informations importantes sur l'hétérogénéité du système étudié. Et les mesures de longs temps de diffusion mettent en évidence la présence de sites de diffusion lente, comme des micro-domaines lipidiques. Cette approche, lorsqu'elle est conduite sur un grand nombre de cellules, peut nous permettre d'obtenir des informations très précises sur la micro-viscosité des membranes, et donc sur son organisation locale.
Collaborations :
J-M. Millot et P. Jeannesson, Unité MEDyC (Matrice Extracellulaire Dynamique Cellulaire), UMR CNRS 6237, Faculté de Pharmacie, Reims, France.
Publications récentes en relation avec ces travaux :
[1]. Surface modified single molecules free-diffusion evidenced by fluorescence correlation spectroscopy, C. Boutin, R. Jaffiol, J. Plain, P. Royer, Journal of Fluorescence (2008) in press (on line).
[2]. Effect of different agents onto multidrug resistant tumor cells revealed by fluorescence correlation spectroscopy, C. Boutin, Y. Roche, C. Millot, R. Deturche, J. Plain, P. Jeannesson, M. Manfait, P. Royer, J-M. Millot, R. Jaffiol, Spectroscopy (2008) in press.